全式金pEASY®-Blunt克隆試劑盒(CB101-01)包含LacZ基因,在含有IPTG和X-gal的平板培養(yǎng)基上,可進行藍白斑篩選,適用于平端克隆。
全式金pEASY®-Blunt克隆試劑盒(CB101-01)的產(chǎn)品組分包括pEASY®-Blunt Cloning Vector、Control Template、Control Primers、M13 Forward Primer、M13 Reverse Primer、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell等,
產(chǎn)品特點:
快速:僅需5分鐘。
簡單:加入片段即可。
高效:陽性率高。
提供氨芐青霉素和卡那霉素兩種篩選標記,便于根據(jù)實驗選擇篩選標記。
測序引物:M13 Forward Primer,M13 Reverse Primer,T7 Promoter Primer。
T7 Promoter用于體外轉(zhuǎn)錄。
Trans1-T1感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率高,生長速度快,確??寺?shù),節(jié)約選時間。
操作方法:
1、PCR產(chǎn)物的制備
(1)引物要求:引物不能磷酸化。
(2)酶的選擇:擴增產(chǎn)物為平端的高保真DNA聚合酶,如FasP/,KD Plus DNA Polymerase。
(3)反應條件:為了保證擴增產(chǎn)物的完整性,擴增反應需要5-10分鐘后延伸。反應結(jié)束后,電泳檢測PCR產(chǎn)物的量和質(zhì)量如果擴增產(chǎn)物有多條帶,建議凝膠回收目的片段。
2、克隆反應體系
(1)加入
組分 | 規(guī)格 |
PCR Product | 0.5-4μl |
pEASY®-Blunt Cloning Vector | 1μl |
(2)輕輕混合,室溫(20℃-37℃℃) 反應5分鐘。反應結(jié)束后,將離心管置于冰
3、推薦克隆反應條件
· 最佳插入片段DNA量
載體與片段摩爾比=1:7
可以粗略地按照“1 kb 20 ng"的比例計算。(如1 kb加20 ng、1.5 kb加30 ng等)
· 最佳載體使用量:1μl
· 最佳反應體系:3-5 m,體積不足時可以補充無菌水。
· 最佳反應時間
(1)片段長度為0.1-1kb(含1 kb):5-10 min
(2)片段長度為 1-2 kb(含2 kb):10-15 min
(3)片段長度為 2-3 kb(含3 kb):15-20 min
(4)片段長度為3 kb 以上:20-30 min
· 最佳反應溫度:25℃,如片段是高GC含量,可以37℃反應。(推薦用PCR儀控溫)
4、轉(zhuǎn)化
(1) 加連接產(chǎn)物于50 m 7ans1-T1感受態(tài)細胞中(在感受態(tài)細胞剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物),輕彈混勻,冰浴20-30分鐘。
(2) 42℃水浴熱激30秒,立即置于冰上2分鐘。
(3) 加250 ml平衡至室溫的SOC或LB培養(yǎng)基,200rpm、37℃培養(yǎng)1小時。
(4) 取8u500 mM IPTG和40 wl 20 mg/mlX-gal混合,均勻地涂在準備好的平板上,37℃培養(yǎng)箱中放置30分鐘。
(5)待IPTG和X-gal被吸收后,取200ml菌液均勻地涂在平板上,在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)(為得到較多克隆,1.500xg離心1分鐘,棄掉部分上清,保留100-150 m,輕彈懸浮菌體,取全部菌液涂板)。
產(chǎn)品選購:
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
CB101-01 | pEASY®-Blunt Cloning Kit | 20 rxns |